2017年12月6日｜纽约（基因组网站）——约翰霍普金斯大学教授Bert Vogelstein实验室的研究人员发现了一对潜在的卵巢癌肽生物标志物。
本周，发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》上的一项研究介绍了这项工作，来自Vogelstein实验室的教员、该研究的第一作者王磬说，“这些研究成果源于实验室的努力，我们实验室以往专注于癌症基因组学，而现在我们会更努力地进入蛋白质组学和蛋白质生物标志物领域。”
王磬与其同事通过的开发选择性反应监测系统（SRM）技术方法验证了这些肽生物标记物。该方法采用轻标肽和广泛分级，最终能够在血浆中对候选生物标志物进行高度敏感和可重复的定量。
Vogelstein是约翰霍普金斯医学院和Sidney Kimmel综合癌症中心的肿瘤学和病理学教授，也是癌症基因组学的先驱。虽然他的实验室主要集中于基因组学的研究，但团队如今也在探索蛋白质和肽生物标记物在早期检测等方面的潜力于价值。
例如，在9月份发表的一篇PNAS论文中，Vogelstein团队综合使用循环肿瘤DNA与四种基于血液的蛋白质标记物来筛查早期胰腺癌。使用这组标记物，他们能够在64%的患者中检测到早期疾病，相比之下，ctDNA分析仅为30%，蛋白质分析仅为49%。
正如Vogelstein当时所说，相当一部分I期癌症似乎没有可检测到的ctDNA，这意味着研究人员将不得不通过研究其他物质来提高这种早期检测方法的灵敏度。同时，蛋白质和肽生物标志物可能相对来说特异性较差，导致产生大量假阳性的结果。研究人员希望将这两种工具结合起来，以提高这类检测的性能，使其能够用于癌症的早期检测。
王磬博士说:“我们正试图建立一种更敏感、更特异的检测方法，特别是对早期癌症的诊断。蛋白质具有最好的灵敏度，但特异性需要检测ctDNA或特定突变蛋白质，这就是底层逻辑。”
“虽然癌症相关肽和蛋白质在理论上可能比ctDNA在早期疾病中更丰富，但实际上在临床样品中检测与定量这些物质还是会面临相当大的挑战，”王磬博士说，“这是蛋白质组学和开发蛋白质生物标志物相关工作的核心难题。”
与领域中许多人一样，王磬博士指出，蛋白没有针对蛋白质的PCR，且缺乏这种放大技术，因此研究人员需要能够筛选血浆的复杂性和高动态范围的仪器和技术，以挑选出他们目标特定标志物。
研究人员正在寻求各种方法来解决这个问题，包括富集前处理方法到不同分离技术的探索。其中一个关键的挑战是，需要找到临床验证中运行大量样品所需的高通量与质谱工作流程的时间二者之间的平衡，使得质谱工作流程能够对常见的低丰度分子进行高灵敏度和可重复性的定量。
王磬博士及同事在《PNAS》中描述了其开发的SRM以灵敏度为代价来换取吞吐量，这给上述问题提供了一个解决方案。
该方法被称为SAFE-SRM，通过广泛的分馏操作将患者样本分成更小、更简单的子样本，然后通过SRM进行分析。该方法类似于太平洋西北国家实验室研究人员开发的Deep-Dive SRM方法，同样也是通过进行广泛的分馏操作来实现更灵敏的SRM分析。
然而，王磬博士指出，SAFE-SRM使用轻标标肽，比Deep-Dive SRM方法中使用的重标标肽便宜得多。他补充道，重标记的标准品会引起离子抑制效应，从而降低检测的灵敏度。根据PNNL研究人员的说法，Deep-Dive SRM方法可以定量血清中的蛋白质至10pg/ mL范围。SAFE-SRM方法能够测量PNAS研究中确定的肽基脯氨酸顺式反式异构酶A (PPIA)肽，作为潜在的卵巢癌标志物，检测限（LOD）为9pg/ mL，定量限（LOQ）为90pg/ mL。
然而，SAFE-SRM使用了预先去除高丰度蛋白质方法，这是Deep-Dive SRM没有使用，这一步骤虽提高了灵敏度，但昂贵且可能影响重复性。
由于涉及广泛的分离过程，两种方法均不适用于大规模的临床验证。王磬博士指出，常规的SAFE-SRM实验需要通过识别一组特定的候选肽来验证，这通常意味着将样本分割成至少20个组分，每个组分随后都需要在70分钟的液相色谱(LC)梯度中进行分析。
“所以，我们目前每天大约只能分析一个病人的样本”他补充道。但若研究人员减少所测量肽的种类，那么每天样本处理量可以提升至大约20个。
王磬博士建议，应用多标的方法或许我们可以进一步将样本处理量提高至每天100到200个。但这种方法还未建立优化流程，且可能会增加工作流的成本和复杂性。
最有可能的是，广泛的临床验证将最终使用免疫分析法进行，如他与同事正在研究的针对两种PPIA肽的ELISAs方法。
研究人员通过对50名健康人、18名卵巢癌患者、13名胰腺癌患者和18名结直肠癌患者的血浆样本进行分析，发现了这些肽。目前，他们确定了641个候选肽标记，其中318个可重复检测。
然后，通过使用SAFE-SRM方法测量了94个不同样本中的318个肽，其中48个来自健康对照，14个来自结直肠癌病例，14个来自卵巢癌病例，18个来自胰腺癌病例。研究人员对这些多肽进行了定量分析与数据深入挖掘，以探究是否存在某个或某些多肽组合，能够精确地标示样本的起源，结果成功识别出两个PPIA多肽，说明这些多肽有潜力成为卵巢癌的生物标志物。
研究人员利用SAFE-SRM技术，对73个独立队列的样本进行了两种特定肽的测量。这些样本包括35个卵巢癌患者的样本、14个健康对照者的样本，以及24个胰腺癌患者的样本。在卵巢癌患者的35个血浆样本中，有20个样本检测到了至少一种目标肽；相比之下，所有健康对照组的样本均未检出这两种肽，而在胰腺癌患者的24个样本中，仅有1个样本检出了其中一种肽。
目前，王磬博士及其团队正在积极收集更多的临床样本，并计划对3000名患者采用免疫分析法的肽检测。此外，团队正在使用SAFE-SRM工作流程，在另外17种不同癌症类型中筛选蛋白质和肽标记物，同时还致力于通过自动化部分方法（包括质谱峰的识别）来提升检测效率。
同时，Vogelstein实验室也正在开发一种基于质谱的蛋白质组学策略，旨在鉴定癌症患者在蛋白质层面的基因突变，以期更精确地识别潜在药物靶点。王磬博士指出，“一个患者可能携带一个关键突变（热点突变）和多达100个其他非关键突变，仅凭基因数据很难判断哪些突变在蛋白质层面得到了表达。”
“因此，我们正在开发一种基于质谱的方法，能够从患者的血液和肿瘤中检测到并以定量这些特定的突变蛋白质或肽。”王磬博士补充到。
参考：Vogelstein Lab Moves Further Into Proteomics With Mass Spec-Based Cancer Study.
